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產品目錄
TRIzon總RNA提取試劑操作步驟
發布時間:2022-06-23 點擊量:145

TRIzonRNA提取試劑說明書

 

TRIzon Reagent

 

目錄號:K0580

 

保存條件:2-8℃避光保存。

 

 

組分說明

 

                 Cat. No.                  K0580        K0580A

                 TRIzon Reagent        20 ml        100 ml

 

 

              本產品僅供科研使用,請勿用于臨床診斷及其他用途  

 

 

產品簡介

 

  TRIzon是廣譜型總RNA提取試劑。實驗操作快速方便,顏色鮮明,便于分層。本

試劑適用范圍廣泛,可以從動物組織、植物材料、各種微生物及培養細胞等樣品中提

取總RNA。樣品在TRIzon中被充分裂解的同時能夠最大限度地保證 RNA的完整性。在

加入氯仿離心后,溶液會分成三層:上層無色水相、中間層和下層紅色有機相,RNA

分布在上清層中。收集上清層后,經異丙醇沉淀便可以回收得到總RNA。提取的總

RNA完整性好,無蛋白和 DNA污染,可用于各種分子生物學常規實驗,如 RT-PCR

Real-time RT-PCRNorthern BlotDot Blot、體外翻譯等。

 

實驗前準備及重要注意事項

 

1.預防RNase污染,應注意以下幾方面:

   1)使用無RNase的塑料制品和槍頭,避免交叉污染。

   2)玻璃器皿應在使用前于180℃高溫下干烤4小時,塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸

   10分鐘,用水徹底沖洗后高壓滅菌。

   3)配制溶液應使用無RNase的水。

   4)操作人員戴一次性口罩和手套,實驗過程中要勤換手套。

2.提取的樣品避免反復凍融,否則影響RNA提取得率和質量。

3.本品中含有苯酚,具有毒性和腐蝕性。如果吸入體內、接觸皮膚、吞食等會導致中

   毒、灼傷以及其他身體傷害。使用本制品時應穿戴防護物品,如防護服裝、手套、

   眼罩、面罩等。如果不小心接觸到眼睛,應立即用大量的水沖洗并前往醫院治療。

4.樣品用TRIzon 勻漿后,如不即刻加入氯仿,置于-70℃下可放置一個月以上。

5.保存在75%乙醇中的RNA沉淀,2-8℃可以保存一周,-20℃條件下可以保存1年。

   RNA半衰期比較短,容易降解,建議提取后盡快進行后續實驗,如反轉錄成cDNA

   Northern Blot等。

6.若下游實驗對DNA非常敏感,建議用不含RNaseDNase  I(貨號:YJ2090A)對

   RNA進行處理。

 

自備試劑:氯仿、異丙醇、75%乙醇、無RNase的水(新開封或提取RNA專用)。

 

操作步驟

 

1.各種材料的處理

   1a.植物組織:取新鮮植物組織在液氮中充分研磨或將植物組織剪碎后直接在TRIzon

   中迅速研磨,每30-50 mg組織加入1 ml TRIzon,混勻。

   注意:樣品體積一般不要超過TRIzon體積的10%

   1b.動物組織:取新鮮或-70℃凍存的動物組織盡量剪碎,每30-50 mg組織加入1 ml

   TRIzon,勻漿儀進行勻漿處理。或在液氮中研磨后加入TRIzon 1 ml混勻。

 

   注意:樣品體積一般不要超過TRIzon體積的10%

   1c.單層培養細胞:吸去培養液,可直接在培養板中加入適量TRIzon(每10 cm2面積

   需要1 ml TRIzon),用取樣器反復吹打使細胞裂解。也可用胰蛋白酶處理后,將細胞溶液轉移至RNase-Free的離心管中,300×g離心5 min,收集細胞沉淀,仔細吸除所有上清,加入TRIzon 1 ml混勻。

 

   注意:1)收集細胞數量不要超過1×107

         2TRNzol加量根據培養板面積決定,不是由細胞數決定。如果TRIzon加量不足,可能導致提取的RNA中有DNA污染。

 

   3)收集細胞時一定要將細胞培養液去除干凈,否則會導致裂解不完全,造成RNA的產量降低。

   1d.細胞懸液:離心收集細胞。每5×106   -1×107動物、植物和酵母細胞或每107細菌

   注意:細胞加入1)加入1 mlTRIzon TRIzon前不要洗。 滌細胞,以免RNA降解。

   2)一些酵母和細菌細胞可能需要勻漿儀或液氮研磨處理。

1e.血液處理:直接取新鮮的血液,加入3倍體積TRIzon(推薦0.25 ml全血加入0.75 ml

   TRIzon),充分振蕩混勻。

   1f.可選步驟:對于蛋白、脂肪、多糖或胞外物質含量高的樣品,如肌肉組織、脂肪組

   織或植物的塊莖,可以在勻漿處理后4℃,12,000 rpm~13,400×g)離心10分鐘以除去不溶物質,此時沉淀中含胞外物質、多糖和高分子量的DNA,而RNA存在于上清中。

2.樣品中加入TRIzon后反復吹打幾次,使樣本充分裂解。室溫放置 5分鐘,使蛋白核

   酸復合物完全分離。

3.向以上溶液中加入氯仿,每使用1 ml TRIzon加入0.2 ml氯仿,蓋好管蓋,劇烈振蕩

   15秒,室溫放置2-3分鐘。

4412,000  rpm離心15分鐘,此時樣品分成三層:紅色有機相,中間層和上層無色

   水相,RNA 主要在水相中,把水相(約600 μl)轉移到一個新的RNase-Free離心管

   (自備)中。

 

    5.在得到的水相溶液中加入等體積異丙醇,顛倒混勻,室溫放置10分鐘。

    6412,000 rpm離心10分鐘,棄上清。

    7.加入75%乙醇(用無RNase的水配制)洗滌沉淀。每使用1 ml TRIzon1 ml 75%乙醇對沉淀進行洗滌。

    8412,000 rpm離心3分鐘,小心吸棄上清,注意不要吸棄RNA沉淀。

       注意:剩余的少量液體可短暫離心,然后用槍頭吸出,注意不要吸棄沉淀。

    9.室溫放置2-3分鐘,晾干。加入30-100 μlRNase的水,充分溶解RNA,得到的RNA   保存在-70℃,防止降解。

 

       注意:沉淀不要過分干燥,以免難于溶解。

 

 

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